1、从柱离心式产品的流行看经典方法的缺点 （或者操作重点）

柱式方法的风行是无法否定的现实。下面通过柱式方法与经典方法的比较，看一看如何注意经典方法的操作重点。

裂解，二者几乎没有任何区别。去蛋白质，柱式靠的是柱材料对蛋白质吸附力低这一特点，将蛋白质残留控制在比较低的水平 (并不是/也不能彻底去除)；经典方法最常用的是 PC 抽提，可以将蛋白质去除得更彻底一些。其它大分子杂质 - 如多糖等 - 的去除，柱式的与蛋白质的去除相似，但经典方法中却没有如此方便的对应方法。小分子物 (盐等) 的去除，是柱式方法最优势所在。如果柱子设计没有问题，离心后柱子中残留的液体稳定而少；柱式的洗涤具有“流水洗涤”的效果；柱式中的核酸是不成团块的 - 这三个特点决定了柱式的洗涤效率比经典的洗涤效率高，所以，柱式纯化的核酸纯度比较高。

2、  应该使用多少菌液？

根据我们的经验，如为高拷贝质粒（如：pUC118等），使用2 ml培养液与4 ml培养液纯化的质粒DNA的收量差别不是很大，可以纯化到20-25 μg的高纯度质粒DNA。如提取地拷贝质粒或大于10 kb质粒，建议使用5-10 ml的菌液（可分几管收集菌体，按比例加入溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ，再将离心上清分批转移至DNA纯化柱），吸附和洗脱的时间可以适当延长，洗脱时使用的溶液Eluent应在60℃水浴预热。高纯度质粒小提试剂盒所配硅胶柱的最大吸附量是40 μg，满足绝大多数实验所需用量。

3、溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ的用量问题

溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ的比例是固定的，如果增加或减少用量都请按比例变化，但是一般来说，用量原则是确保能彻底裂解样品，同时使裂解体系中核酸的浓度适中（具体表现是加入溶液Ⅱ后，能形成澄清的裂解溶液）。浓度过低，将导致沉淀效率低，影响得率；浓度过高，去除杂质的过程复杂且不彻底，导致纯度下降。溶液的用量是以样品中蛋白质的含量为基准的，而不是以核酸含量为基准。

4、 溶液Ⅱ操作时要注意的事项

在反应液充分的时候，第一，反应的时间不能过长，长时间的碱性条件会打断DNA，基因组DNA一旦发生断裂，只要是50－100 kb大小的片断，就没有办法再被溶液Ⅲ沉淀了；第二，不得激烈振荡，不然基因组DNA也会断裂最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带。

5、质粒质量检测

将抽提好的核酸直接用于后续的实验，是唯一可靠的检测方法；除此之外的检测方法，都是相对的，而且并不十分可信。目前用于正式实验前检测核酸质量的方法，一是电泳，二是紫外分光光度仪。电泳检测的主要是核酸的完整性和大小，只要核酸不是太小或者太大 (超出电泳分离范围)，该方法还是非常可信的；电泳还可以用于估计核酸的浓度，但其准确度与经验有关；另外，电泳也可能提供某些杂质污染的信息，但是同样与经验有关。紫外分光光度仪检测的是纯度和核酸含量，然而，由于紫外分光光度仪不能确保非常准确，而该仪器的灵敏度又非常高，所以，提供的结果并不十分可信。一般讲，同时进行紫外和电泳检测，综合二者的结果，可以做出一个更合理的判断。但由于这两个方法都有缺陷，所以，即使出现坏的结果能用于后续实验而好的结果却不能用于后续实验，也不用大惊小怪。

6、 质粒电泳条带

琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时，多数情况下你能看到三条带，但不要认为你看到的是超螺旋、线性和开环这三条带。碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNA，用EcoRI来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到线性质粒DNA的位置与这三条带的位置不一样。其实这三条带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。如果你不小心在溶液II加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是20-100kb的大肠杆菌基因组DNA的片断。 非常偶然的是，有时候抽提到的质粒会有7－10条带，这是由于特殊的DNA序列导致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈数不同）所致。

7、 核酸的保存

纯化后的核酸，最后多使用水或者低浓度缓冲液溶解；其中 RNA 以水为主，DNA 则多以弱碱性的 Tris 或者 TE 溶解。经典的 DNA 溶解方法多提倡使用 TE 溶解，认为 EDTA 可以减少 DNA 被可能残留下来的 DNase 降解的风险；如果操作过程控制得当，DNase 的残留几乎是可以忽略的，完全可以直接使用 Tris 或者水 (pH 接近 7) 溶解 DNA。基本上，核酸在保存中的稳定性，与温度成反比，与浓度成正比。

如果温度合适，保存中核酸发生降解或者消失，首要原因是酶残留导致的酶解，第二个原因则是保存核酸溶液的 pH 值不合适导致的水解 (RNA 在弱酸性更稳定，而 DNA 在弱碱性更合适)。还有一个不为人重视的，就是 EP 管对核酸的影响。首先一定要坚信一点，那就是核酸一定会与装它的容器的接触面发生反应，达到某种均衡。EP 管的材质，首先可能吸附核酸，其次还可以诱导核酸的结构发生某些变化，如变性。在核酸的浓度比较高时，这个现象可能观察不到；当核酸浓度很低时，则比较明显了。在低浓度的核酸中加入 Geletin,Glycogen,BSA 可以稳定核酸，虽然已经为实验所证明，但许多实验人员并没有将该建议当回事。现在制造 EP 管的材料远多于过去。这些新出现的材料，在强度、透明度等物理特征方面可能比原来的纯 PP 材质要好许多，但其化学特征，尤其是对核酸稳定性的可能影响，远没有研究透彻。正如现在的质粒可以改造得越来越适用某些要求一样，其负面产物可能是，抽提的质粒电泳的构型越来越多：除了原来的三种带型外，还可能出现 denatured cc 、multimeric forms of cc 等等带型。

8、 核酸抽提中的温度问题

核酸抽提中的温度问题，也是一个值得关注的问题。首先要明确的一点是，任何一个温度条件，对某些方面有利，同时也一定会有不利的一面。如沉淀，低温操作会提高得率，但也会增加杂质的残留。任何一步操作该用什么温度为好，应该是利弊权衡的结果。基本上，除了一些特殊的步骤，如消化等外，用室温是最好的选择。低温的确可以减低酶的活性，但低温同时也降低了这些酶被裂解液中的试剂灭活或者抑制的速度，此消彼长，没有办法给出结论的。