通用RNA提取试剂盒

产品组分

需要自备的溶液

●  氯仿

●  无水乙醇

产品说明

通用RNA提取试剂盒是经过改进开发的新一代产品，提高了裂解液的裂解能力和提取的灵敏度，通过在特定适宜的条件下特异、可逆地结合RNA，而各种蛋白质和其他杂质均可被去除掉，同时改进的硅基质膜增强了对RNA的吸附能力，得到的RNA纯度更好，质量更高。该试剂盒可从各种细胞或组织中快速提取总RNA，每个吸附柱每次可处理50–100 mg 组织或5×10⁶ 细胞，可同时处理大量不同样品，一个小时内即可完成反应。提取的总RNA没有DNA和蛋白的污染，可用于Northern blot、Dot blot、polyA 筛选、体外翻译、RNase保护分析和分子克隆等。

保存条件

溶液RL应在2-8℃避光保存，其他溶液和纯化柱室温保存。

注意事项---------------------------------------------------------------------------------------------------------
●  初次使用溶液RPI和溶液RW前，需按比例加入无水乙醇。18 ml溶液RPI中加入12 ml无水乙醇（3:2），12 ml溶液RW中加入48 ml无水乙醇（1:4）。

●  严防操作环境、使用的容器、耗材和试剂的RNase污染。操作过程中勤换手套。

●  使用本产品提取的RNA一般不含有DNA污染。在极少数情况下（与组织pH值等相关），如果有DNA污染而又必须去除，则可以用RNase-free的DNase处理样品。

●  请严格遵照操作步骤操作。

●  不同起始材料的用量及溶液RL的用量不同（参见下表），过多或过少的使用量都可能影响RNA的质量或产量。若起始材料量很少，RNA预计产量很低，在异丙醇沉淀时，可加入20mg/ml的肝糖原溶液0.5-1 μl促进RNA沉淀。

●  有关RNA的吸光度说明如下：

260nm、320nm、230nm、280nm下的吸光度分别代表核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白质等有机物的污染程度，质量较好的RNA的R值应在1.8-2.0之间，当R<1.8时，溶液中的蛋白质等有机物的污染比较明显；当>2.2时，说明RNA已经被水解成单核苷酸。

●  RNA浓度=（OD₂₆₀-OD₃₂₀）*稀释倍数*0.04 μg/μl。

操作步骤---------------------------------------------------------------------------------------------------------

第一次使用前应在溶液 RPI、溶液 RW中加入无水乙醇，加入量请参见瓶上标签。

1.  样品处理

● 组织：将组织在液氮中磨碎。每50–100 mg组织加1 ml溶液RL，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过溶液RL体积的十分之一。

● 单层培养细胞：直接在培养板中加入溶液RL裂解细胞，每10 cm² 面积加1 ml溶液RL。用取样器抽打几次。

●  溶液RL的加入量根据培养瓶面积决定，不是由细胞数决定。如果加量不足，可能导致提取的RNA中有DNA污染。

c.  细胞悬液：离心取细胞，弃上清。每5–10×10⁶动物细胞和植物细胞加入1 ml溶液RL。加溶液RL前不要洗涤细胞，以免降解mRNA。

2.  将匀浆样品在15–30℃放置5 min，使得核酸蛋白复合物完全分离。

3.  可选步骤：4℃ 12,000 rpm (~13,400×g) 离心5分钟，取上清，转入一个新的无RNase的离心管中。

●  如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等，可加此步骤离心去除。离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，RNA存在于上清溶液中。

（如样品含有较多多糖多酚，请增加以下步骤，在上清液中加入0.2×上清液体积的5 M NaCl及1×上清液体积的酚/氯仿（1:1），混匀，12000 rpm 离心5-10 min ，取上清液加入等体积氯仿，混匀，12000 rpm 离心5-10 min，至第4步。）

4.  加入200 μl氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15 s，室温放置3 min。

5.  4℃ 12,000 rpm离心10 min，样品会分成三层，从上至下依次是：无色的水相，白色的中间层和黄色的有机相，RNA主要存在于水相中，水相的体积约为所用溶液RL试剂的60%。把水相转移到新管中，进行下一步操作。注意不要吸到中间层。

●  第一次使用前应在溶液 RPI、溶液RW中加入无水乙醇，加入量请参见瓶上标签。

6.  缓慢加入0.5 倍体积无水乙醇，混匀（此时可能会出现沉淀）。将得到溶液和沉淀一起转入纯化柱中，4℃ 12,000 rpm离心30 s。4℃ 12,000 rpm离心30 s，弃掉收集管中的废液。
●  若溶液体积大于纯化柱容积（700 μl），可分两次离心。

7.  向纯化柱中加入500 μl溶液RPI（使用前请先检查是否已加入乙醇），4℃ 12,000 rpm离心30 s，弃废液。    

8.  向纯化柱中加入500 μl溶液RW（使用前请先检查是否已加入乙醇），室温静置2 min， 4℃ 12,000 rpm离心30 s，弃废液。

9.  向纯化柱中加入500 μl溶液RW，室温静置2分钟，4℃ 12,000 rpm离心30 s，去除残余液体。

10.  将纯化柱放入2ml收集管中，4℃ 12,000 rpm离心2 min，去除残余液体。

●  此步骤的目的是将纯化柱中残余的漂洗液去除，离心后将纯化柱在室温放置片刻，或置于超净工作台上通风片刻，以充分晾干。如果有漂洗液残留，可能会影响后续的RT等实验操作。

11.  将纯化柱转入一个新的离心管中，加30–100 μl RNase-free ddH₂O，室温放置2 min，4℃ 12,000 rpm离心2 min。

●  洗脱缓冲液体积不应少于30 μl，体积过小影响回收效率。且RNA应保存在-70℃（-80℃），以防降解。

●  如果想提高RNA得率，可重复上步操作一次，合并两次得到的溶液。